Materi Praktikum Mikrobiologi Cara Pembuatan Preparat

 Materi Praktikum Mikrobiologi

Cara Pembuatan Preparat

Tujuan dilakukannya praktikum pembuatan Preparat yaitu nantinya diharapkan agar kita nantinya dapat membuat preparat dari kultur cair dan Mengerti teknik pewarnaan

       Dalam pembuatan preparat alat dan bahan yang digunakan yaitu mikroskop, objek glass, kawat ose, Bunsen, pipet tetes, koloni mikroba, agar miring, alcohol 95%, larutan Kristal violet, fuchsin basa, larutan lugol. Proses pembuatan preparat bakteri yaitu kawat ose dipijarkan diatas api Bunsen. Setelah itu diambil koloni bakteri pada agar miring PCA (Plate Count Agar) lalu taruh koloni bakteri tersebut diatas objek glass. Penempatan koloni bakteri tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu ditambahkan fuchsin basa dan Kristal violet pada kaca preparat dan didiamkan selama 1 menit, lalu difiksasi dimana fungsi fiksasi yaitu melekatkan mikroba pada objek glass, memperjelas pengamatan dibawah mikroskop dan membunuh mikroba. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar.

Mikroorganisme yang ada di ala mini mempunyai morfologi, struktur daan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri.  Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologinya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Dwidjoseputro, 1989).
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Volk dan Wheeler, 1993).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.  Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negative. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakteri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negative maka disebut zat warna asam. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh factor-faktor seperti fiksasi, pelunturan warna, substrat, intesifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, sprilum, dsb) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarnaan sederhana. Istilah pewarnaan sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Factor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, pelunturan warna, substrat, intesifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan alcohol maka semua zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap alcohol.
Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan cirri khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1989).

Kebanyakan bakteri dapat diwarnai dengan pengecatan sederhana dan pengecatan gram atau pengecatan bertingkat, tetapi beberapa genus anggota dari genus mycobacterium bersifat resisten dan hanya dapat dilihat dengan metoda tahan asam.

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh larena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

Pewarnaan sederhana, sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas objek gelas yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspense bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspense bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop.
 Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan meletakkan sel bakteri pada objek gelas tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005).
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transaparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bisa yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair.kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990).

Pewarnaan secara gram adalah pewarnaan yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi dan klasifikasi bakteri, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membrane sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negative. Bakteri gram positif mempunyai dinding sel tebal dan membrane sel selapis. Sedangkan bakteri gram negative mempunyai dinding sel tipis yang berada diantara dua lapisan membrane sel. Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya, maka pewarnaan ini juga disebut pewarnaan diferensial atau pewarnaan bertingkat. Prinsipnya bakteri dengan pewarnaan utama yaitu dengan Kristal violet akan berwarna ungu, melalui fiksasi warna dengan lugol akan menguatkan pelekatan warna utama, penambahan alcohol akan melunturkan atau memucatkan zat warna utama sehingga pada sel gram negative sel menjadi tidak berwarna tetapi pada sel gram positif tidak mengalami pelunturan sehingga tetap berwarna ungu. Pada pemberian pewarnaan tandingan yang berbeda dengan pewarna utama yaitu fucin basa menebabkan bakteri gram negative akan menyerap warna tersebut menjadi merah.

Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku yakni sebagai berikut: mempersiapkan kaca objek. Kaca objek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat lapisan dari bakteri yang diwarnai. Mempersiapkan preparat , preparat yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis. Preparat ini dapat berasal dari biakan cair atau padat. Biakan cair suspense sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca objek lalu preparat pada kaca objek lebar dan biakan mongering dengan cara fiksasi.

Biakan padat bakteri yang kulturnya pada media padat tidak dapat langsung dibuat preparat seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dahulu, dengan cara meletakkan setetes air pada kaca objek lalu dengan jarum inokulasi diambil bakteri dari biakan padat, biarkan mongering atau dilakukan dengan cara fiksasi.

Alat dan Bahan
    Alat dan bahan yang kita butuhkan dalam pembuatan preparat ini diantaranya :

       1.      Kaca objek
       2.      Biakan dari e.coli pada agar kaldu miring
       3.      Jarum inokulasi
       4.      Gelas kimia berisi air dengan sebatang pengaduk kaca
       5.      Lampu Bunsen
       6.      Kertas saring
       7.      Mikroskop
       8.      Kapas
       9.      Larutan lugol
   10.      Alcohol 90%
   11.      Gelas kimia 100 mL
   12.      Stopwatch
   13.      Fuchin basa

Praktikum

a.    Pembuatan preparat sederhana

                1.      Mensterilkan kaca preparat dengan alcohol 90%
                2.      Mengambil akuades dengan pipet tetes
                3.      Meletakkan diatas preparat
                4.      Mengambil biakan bakteri menggunakan jarum ose, lakukan secara steril
                5.      Meletakkan biakan ke dalam preparat hingga rata
                6.      Melakukan fiksasi terhadap preparat
                7.      Meneteskan Kristal violet dan fucin basa ke atas preparat
                8.      Menunggu hingga 1 menit
                9.      Membilas dengan akuades
            10.      Mengamati dengan mikroskop.

b.   Pembuatan preparat berwarna menurut gram

                1.      Melakukan hal ang sama (1-6) pada pembuatan preparat sederhana
                2.      Meneteskan gram A (Kristal violet) ke atas preparat tunggu hingga 1 menit

                3.      Membilas dengan akuades
                4.      Meneteskan gram B (larutan lugol) ke atas preparat tunggu hingga ¾ menit
                5.      Membilas dengan akuades
                6.      Meneteskan gram C (alcohol) ke atas preparat tunggu hingga 1 menit
                7.      Membilas dengan akuades
                8.      Meneteskan gram D (fucin basa) ke atas preparat, tunggu hingga 3 menit
                9.      Membilas dengan akuades
              10.      Mengamati di mikroskop.


Analisis dan Pembahasan

           Pada praktikum ini kita membuat preparat bakteri, sebelum membuat preparat bakteri usahakan semua alat dan media yang digunakan tersebut sudah steril. Sebelum memindahkan bakteri ke kaca objek kita harus memijarkan dulu jarum ose dan tabubg reaksi bakteri, setelah itu ambil sedikit saj bakteri dari biakan induk bakteri lalu gesekkan pada kaca objek secara hati-hati. Kalu bakteri terlalu tebal tetesi dengan air, dan sebarkan secara merata.

Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis agar bakteri dengan mudah dapat diidentifikasi. Teknik yang digunakan dalam pembuatan preparat ada berbagai macam tergantung pada specimen dan penelitian yang dibutuhkan, antara lain fiksasi yaitu suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistic dengan menggunakan Kristal violet.

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas bentuk dan ukuran bakteri seperti dinding sel dan vakuol, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia ang khas dari pada bakteri dengan zat warna serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.

Ada beberapa factor yang memepngaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histology yaitu Cristian Gram (Capucino dan Shesman, 1983).

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan atu jenis zat warna untuk mewarnai organism tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitiplasmanya bersifat basofilik (suka air dan basa). Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan dalam memberikan zat warna memiliki muatan negative. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negative banyak ditemukan pada permukaan sel. Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersidat alkalin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana adalah Kristal violet dan fucin basa.

Pada pewarnaan sederhana menggunakan satu macam pewarnakristal violet untuk objek gelas yang pertama dan fucin basa untuk objek gelas yang kedua, sehingga ketika diamati dengam menggunakan mikroskop maka pada bakteri e.coli akan terlihat berwarna biru keungu-unguan untuk objek gelas yang pertama dengan Kristal violet, pada objek gelas kedua yaitu dengan fucin basa e.coli terlihat berwarna ungu merah.

Pewarnaan gram atau bertingkat menghasilkan dua kelompok besar bakteri, yaitu gram positif yang berwarna ungu dan gram negative yang berwarna merah. Adanya gram positif dan gram negative disebabkan oleh perbedaan pandangan dinding sel bakteri. Kandungan senyawa peptidoglikan pada dinding sel gram positif lebih tebal dibandingkan pada dinding gram negative. Zat warna yang digunakan pada pengecetan gram meliputi Kristal violet, lugol, alcohol, dan fucin basa. Fungsi dari masing-masing zat warna tersebut adalah:

       1.      Kristal violet

Berwarna ungu dan merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberikan warna mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna ungu.

       2.      Lugol

Merupakan pewarna mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Pemeberian lugol pada pengecatan gram ini dimaksudkan untuk memperkuat pengikat warna oleh bakteri.

       3.      Alcohol
Merupakan solven organic yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri. Pemberian alcohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan:
  • Mikroorganisme tetap berwarna ungu kebiruan
  • Bakteri mejadi tidak berwarna

       4.      Fucin basa

Merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alcohol. Dengan kata lain memberikan warna pada mikroorganisme non target.

Pada pewarnaan gram ini ditemukan bahwa bakteri e.coli setelah diamati dengan menggunakan mikroskop terlihat berwarna ungu kebiruan. Menurut praktikum bakteri e.coli merupakan bakteri gram positif karena dapat mempertahankan warna ungunya. Tetapi menurut referensi e.coli merupakan bakteri gram negative yang tidak mempertahankan warna ungunya sehingga berubah warna menjadi merah.

Kesimpulan

              Dari hasil pengamatan yang sudah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa preparat dari kultur cair. Preparat dibuat dari kultur e.coli. Teknik pewarnaan untuk identifikasi e.coli dilkukan dengan 2 cara yaitu pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram/bertingkat. Berdasarkan teknik pewarnaan tersebut dapat disimpulkan bahwa e.coli merupakan gram negative menurut referensi tetapi menurut praktikum merupakan gram negative.

Sumber Pustaka
  • Camphell, N.A., dan Reece, J.B., 2005, Biologi Jilid 2, Erlangga:Jakarta.
  • Hadioetomo, R.S., 1990, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, Gramedia:Jakarta.
  • Law, W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, Raja Grafindo Persada:Jakarta.
  • Pelczar, M.W., 1986, Dasar-dasar Mikrobiologi 1, UI Pres:Jakarta.
  • Wahyuningsih, 2008, Pengecatan Gram, Universitas Jendral Sudirman, Fakultas Pertanian:Purwokerto.

0 Response to "Materi Praktikum Mikrobiologi Cara Pembuatan Preparat"

Post a Comment