Materi Praktikum Mikrobiologi ||Teknik Aseptik||

Tujuan

Mampu memahami pentingnya teknik aseptic dalam bekerja di laboratorium mikrobiologi lingkungan.

Mampu melakukan teknik aseptic.

Landasan Teori

Mikrobiologi adalah studi tentang kehidupan kecil atau mikroba. Mikrobiologi sangat penting untuk bidang medis di dalam memerangi penyakit. Mikroba berbahaya yang dapat membuat orang sakit disebut pathogen. Mikrobiologi mempelajari pathogen dan bagaimana untuk melawan dan mencegah infeksi. Para ilmuan membuat antibody dan vaksin dari bentuk lemah mikroba untuk mengobati dan mencegah penyakit. Beberapa mikroba penting untuk proses pencernaan dll. Juga digunakan untuk membuat keju dan yogurt.

Memiliki lingkungan kerja yang bersih sangat penting untuk mempelajari mikroba dan juga dalam pengaturan laboratorium, seperti di laboratorium penelitian atau laboratorium medis. Kontaminan dalam laboratorium dapat menyebabkan banyak masalah. Jika seorang peneliti inocules atau menstransfer bakteri tidak benar, maka mencemari mikroba dan dapat membahyakan hasil. Kontaminan seperti pathogen di dalam lingkungan dimana mereka dapat tumbuh dalam jumlah tinggi, pathogen bisa menyebabkan peneliti menjadi sakit.

Di laboratorium mikrobiologi kita menggunakan teknik aseptis untuk mencegah kontaminasi mikrobiologi dan mencegah kontaminasi ruangan dan personil dengan mikroorganisme. Banyak mikroorganisme di laboratorium dan diketahui pathogen. Sehingga kita menggunakan teknik aseptis untuk keselamatan semua personil laboratorium.

Salah satu teknik dasar dalam analisa mikrobiologi adalah teknik aseptis (suatu metoda atau teknik di dalam memindahkan atau menstranfer kultur bakteria dari satu tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur). Teknik ini sangat esensial dan kunci keberhasilan prosedur microbial yang diketahui oleh seseorang yang hendak melakukan analisis mikrobiologi. Pengambilan sampel harus dilakukan secara acak (random sampling). Selain itu digunakan teknik aseptic selama pengambilan sampel agar tidak terjadi pencemaran. Alat-alat yang digunakan harus steril. Bahan makanan cair diambil dengan pipet steril, makanan padat menggunakan pisau, garpu, sendok atau penjepit yang steril (Rachdie, 2006).

Teknik aseptis adalah suatu metode atau teknik didalam memindahkan atau menstranfer kultur bakteria dari satu tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur. Teknik transfer aseptis ini sangat esensial dan kunci keberhasilan prosedur microbial yang harus diketahui oleh seorang yang hendak melakukan analisis mikrobiologi (Pelzcar, M.J. Chan, 2007).

Teknik aseptic sangat diperlukan untuk menghindarkan mikroorganisme dari kontaminan yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Teknik aseptic digunakan sepanjang kegiatan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun praktikannya, untuk alat dan bahan praktikum dapat diterapkan metode sterilitas. Penguasaan teknik aseptic ini sangat diperlukan dalam keberhasilan laboratorium mikrobiologi dan hal tersebut merupakan salah satu metode permulaan yang dipelajari oleh ahli mikrobiologi (Oram, 2001).

Sementara itu menurut Pelczar dan Chan (2007), teknik aseptic sangat penting dalam pengerjaan mikrobiologi yang memerlukan ketelitian dan keakuratan disamping kestrilan yang harus dijaga selalu agar terbebas dari kontaminan yang dapat mencemari. Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan komplek. Beratur-ratus spesies berbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut, saluran pencernaan, dan kulit. Sekali bersin terdapat beribu-ribu mikroorganisme sehingga diperlukan teknik yang dapat meminimalisir seperti pengisolasian.

Alat yang akan digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum harus disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan peralatan tersebut dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada suatu benda.

Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap benda atau substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan setempat oleh panas (kalor), gas-gas seperti formaldehid, etiloksida, atau betapriolakton oleh bermacam-macam larutan kimia oleh sinar lembayung ultra atau sinar gama. Mikroorganisme juga dapat disingkirkan secara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau oleh filtrasi (Curtis, 1999).

Sterilisasi dengan udar kering alat yang umum dikenal adalah oven. Alat ini dipakai untuk mensterilkan alat-alat gelas seperti Erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi dan alat gelas lainnya, bahan-bahan seperti kapas, kain dan kertas dapat disterilkan dengan alat ini. Pada umumnya suhu yang digunakan pada sterilisaasi secara kering adalah 110-180 derajat C selama paling sedikit 2 jam. Lama sterilisasi tergantung pada alat dan jumlahnya (Machmud, 2008).

Sterilisasi dengan uap panas, bahan yang mengandung cairan tidak dapat disterilkan dengan oven sehingga digunakan alat ini. Alat ini disebut Arnold steam sterilizer dengan suhu 100 derajat C dalam keadaan lembab. Secara sederhana dpat pula digunakan dandang. Mula-mula bahan disterilkan pada suhu 100 derajat C selama 30 menit untuk membunuh sel-sel vegetative mikroba. Kemudian disimpan pada suhu kamar selama 24 jam untuk memberi kesempatan spora tumbuh  menjadi sel vegetative, lalu dipanaskan lagi 100 derajat C 30 menit, dan diinkubasi lagi 24 jam dan disterilkan lagi, jadi ada 3 kali sterilisasi. Banyak bakteri berspora belum mati dengan cara ini sehingga dikembangkan cara berikutnya yaitu uap air bertekanan (Machmud, 2008).

Sterilisasi dengan uap panas bertekanan, alat ini disebuT autoklaf untuk sterilisasi ini alat dilengkapi dengan katup pengaman. Alat diisi dengan air kemudian bahan dimasukkan. Panaskan sampai mendidih dan dari katup pengaman keluar uap air dengan lancer lalu ditutup. Suhu akan naik sampai 121 derajat C dan biarkan sampai 15 menit, lalu biarkan dingin sampai tekanan normal dan klep pengaman dibuka, cara ini akan mematikan spora dengan cara penetrasi panas ke dalam sel atau spora sehingga lebih cepat. Untuk bahan yang tidak tahan panas maka cara diatas tidak dapat dipakai (machmud, 2008).

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakikan dengan 3 cara yaitu secar mekanik, fisik dan kimuawi:

1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0,22 mikron atau 0,45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotic.

2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan dengan pemanasan dan penyinaran.

Pemanasan

1. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung. Contoh alat: jarum inoculum, pinset, batang L, dll.
2. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180 derajat C. sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya Erlenmeyer, tabung reaksi, dll.
3. Uap panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air, lebih tepat menggunakan metode ini agar tidak terjadi dehidrasi.
4. Uap air panas bertekanan:  menggunakan autoklaf.

Penyinaran dengan UV

Sinar ultraviolet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior safety cabinet dengan disinari lampu uv.

3. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alcohol.

Saran-saran kerja aseptis:

1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung/cawan/Erlenmeyer sebaikknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminasi masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu.
2. Pinset, batang L, spider, dll dapat disemprot alcohol terlebih dahulu lalu dibakar.
3. Ujung jarum inoculum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang terjadi.
4. Usahakan bagian alat yang dipakai dalam kondisi steril didekatkan ke bagian api.
5. Jika kerja di safety cabinet tidak perlu memakai pembakar Bunsen tapi jika diluar safety cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin kondisi aseptisnya.

Alat dan Bahan

1. Alat yang disterilkan: cawan petri 3 buah, pipet 1 mL 1 buah, pipet 10 mL 1 buah, jarum inokulasi, spreader.
2. Akuades
3. Autoklaf
4. Oven
5. Rak
6. Kranjang alat
7. Kertas/samak kayu
8. Media NA dan NB

Cara Kerja

A.   Sistem Basah

a.    Sistem basah dengan udara bertekanan

1. Mengisi autoklaf dengan akuades hingga pemanasnya terendam semua.
2. Memasukkan alat atau media
3. Menutup pintu autoklaf dan kencangkan baut.
4. Pengatur tekanan udara ditutup.
5. (setelah mendidih) pengatur tekanan udara dibuka.
6. (bila asap habis) menutup tekanan udaranya dan biarkan samapi jarum menunjukkan angka 1,5 kg f/cm2 dan konstan (bila lebih buka pengatur takanan udara kembali).
7. Konstan angaka 1,5 kg f/cm2 selama 15 menit.
8. Membuka pengatur udaranya sehingga jarum turun.
9. Bila angka 0 buka tutup autoklafnya.

b.    Sistem basah dengan diusap memakai alcohol/spritus dan dibakar (untuk alat gelas/porselin).

1. Menyiapkan alat gelas/porselin
2. Mengusapkannya dengan alcohol/spritus.
3. Dibakar.

B.    Sistem Kering

a.    Sistem kering dengan udara panas

1. Menghidupkan oven/incubator.
2. Mengatur temperature pada suhu 105 derajat C.
3. Membungkus alat yang akan disterilkan dengan kertas.
4. (bila temperature sudah 105 derajat C) masukkan alat.
5. Mengoven selama 60 menit.

b.    Sistem kering langsung api

1. Menyiapkan alat logam.
2. Dipijarkan.

Analisis dan Pembahasan

Tindakan untuk membebaskan alat atau media dari mikroba adalah dengan sterilisasi. Secara umum sterilisasi dapat dilakukan dengan cara mekanik, fisik, dan kimia. Teknik aseptis dibutuhkan untuk mencegah ataupun untuk mengurangi kontaminan yang tidak diinginkan. Mikroba memiliki karakteristik serta ciri yang berbeda dalam persyaratan pertumbuhannya. Karakteristik persyaratan pertumbuhan mikroba inilah yang meyebabkan bermacam-macam media penunjang pertumbuhan mikroba.

Proses sterilisasi yang dilakukan yaitu dengan sterilisasi basah dan kering. Sterilisasi basah dilakukan dengan 2 cara yaitu dengan udara bertekanan dan diusap dengan alcohol sedangkan sterilisasi kering dengan 2 cara juga yaitu dengan udara panas dan langsung api.

Dengan autoklaf atau udara bertekanan yaitu alat serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap. Medium yang akan disterilkan di tempatkan di dalam autoklaf ini selama 15 sampai 20 menit. Hal ini bergantung pada banyak sedikitnya barang/alat yang perlu disterilkan. Medium yang akan disterilkan itu lebih baik ditempatkan dalam beberapa botol yang agak kecil daripada dikumpulkan dalam satu botol yang besar. Setelah pintu autoklaf ditutup rapat barulah kran pada pipa uap dibuka dan temperature akan terus menerus naik sampai 121 derajat C. biasanya autoklaf sudah diatur demikian rupa sehingga pada suhu tersebut tekanan ada sebesar 15 lbs (pounds) per inch persegi yang berarti 12 atmosfer per 1 cm. perhitungan waktu 15 atau 20 menit itu dimulai semenjak thermometer autoklaf menunjukkan 121 derajat C. setelah cukup waktu, maka kran uap ditutup dan dengan demikian suhu mulai turun sedikit demi sedikit demikian pula manometernya. Autoklaf tidak boleh dibuka langsung begitu saja. Jika dilakukan demikian maka isi botol yang ada di dalam autoklaf akan meluap ke mana-mana. Sebaiknya ditunggu sampai manometer menunjukkan 0, barulah autoklaf kita buka. Pendinginan dilakukan sedikit demi sedikit. Jika medium mengandung vitamin, gelatin, atau bangsa gula maka setelah sterilisasi sependek-pendeknya dalam autoklaf medium tersebut haruslah segera didinginkan sesudahnya di keluarkan dari autoklaf. Perbuatan atau perlakuan ini perlu untuk menghindarkan terurainya zat-zat tersebut. Dengan autoklaf ini akan mematikan spora dengan cara penetrasi panas ke dalam sel atau spora sehingga lebih cepat. Sterilisasi ini digunakan untuk mensterilkan media nutrient broth dan nutrient agar.

Untuk sterilisasi sistem basah diusap dengan alcohol yang digunakan untuk alat spreader. Selain itu yang harus disterilisasi dengan alcohol adalah telapak tangan agar mikroorganisme yang menempel pada tangan mati sehingga tidak akan mengganggu proses. Meja yang dipakai juga harus disterilkan dari mikroba dengan cara menyemprotkan cairan alcohol pada lingkungan sekitar meja preparasi.

Sterilisasi dengan udara kering, alat yang umum dikenal adalah oven. Alat ini dipakai untuk mensterilkan alat-alat gelas seperti Erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi, dan alat gelas lainnya. Bahan-bahan seperti kapas, kain, dan kertas dapat disterilkan dengan alat ini. Pada umumnya suhu yang digunakan pada sterilisasi secara kering adalah 170-180 derajat C selama paling sedikit 2 jam. Lama sterilisasi tergantung pada alat dan jumlahnya.

Beberapa tabung reaksi diambil sebanyak 5-10 buah dan masing-masing ditutup dengan kapas dan diikat menjadi satu dan dibungkus kertas yang kemudian diikat dengan benang atau karet. Cawan petri , pipet volume dan jarum inokulasi juga dibungkus dengan kertas. Semua alat dimasukkan ke dalam oven. Oven dinyalakan pada suhu 175 derajat C (agar peralatan benar-benar menjadi steril) dan setelah suhu tercapai, sterilisasi dilakukan selama 2 jam. Setelah sterilisasi selesai peralatan didinginkan dan pada hari itu juga peralatan dapat digunakan. Sterilisasi dengan oven dilakukan kira-kira 60-180 derajat C, sterilisasi panas kering ini digunakan untuk alat yang terbuat dari kaca atau gelas, karena barang-barang tersebut akan tetap basah sehabis digunakan.

Kesimpulan

Perlakuan aseptic merupakan perlakuan yang bertujuan agar terbebas dari mikroorganisme. Aseptic diimbangi dengan sterilisasi yang merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminasi dari mikroorganisme yang menempel pada alat atau bahan yang akan dipergunakan untuk analisa selanjutnya.

Teknik aseptic dilakukan dengan dua cara yaitu sterilisasi basah untuk media nutrient broth (NB) dan media nutrient agar (NA). sterilisasi kering untuk cawan petri, pipet, jarum inokulasi dan spreader.

Daftar Pustaka

Adam Syamsunir, 1992, Dasar-dasar Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Perawatan, Jakarta: Buku Kedokteran EGC.

Curtis, Helena, Bornes, 1999, Biology 5^th edition, Worth Publicher Inc, New York.

Hadioetomo, R., 1993, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi, Gramedia, Jakarta.

Jati Wijaya, 2007, Biologi Interaktif, Ganesa Exact, Jakarta.

Machmud, M., 2008, Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba., BPBTP, Bogor.

Orang, Paul, Hummer, 2001, Biology Living System, Glencoe Division Mc Milan Company, Waterville.

Pelczar, Chan, 2007, Elements of Microbiology, Mc Graw Hill Book Company, New York.

Posted by Unknown