Materi Praktikum Mikrobiologi ||Pemeriksaan Bakteri Khusus||

Tujuan
Dapat memeriksa dan mengetahui apa itu bakteri khusus (coliform).

Landasan Teori
Populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Oleh karena itu, dalam mempelajarinya bakteri harus diambil dari alam lalu diisolasikan dalam suatu biakan murni. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya. Biakan murni adalah biakan yang berisi satu jenis bakteri (Pelczar, et al., 1988).
Ada berbagai cara untuk mengisolasi bakteri dalam biakan murni yaitu dengan cara pengenceran, penuangan, penggesekan atau penggoresan, penyebaran, pengucilan satu sel dan inokulasi pada hewan. Masing-masing mempunyai kelebihan dan kekurangannya (Waluyo, 2007).
Cara pengenceran yaitu dengan mengencerkan misalnya 1 ose bakteri dengan air. Lalu hasil pengenceran tersebut dierkan lagi dengan beberapa ketentuan. Hal ini bertujuan untuk mengurangi konsentrasi bakteri (Barazandesh, 2008).
Metode MPN atau JPT dapat digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik tertentu yang terdapat diantara campuran jasad renik lainnya. Sebagai contoh jika digunakan lactose broth maka adanya bakteri yang dapat memfermentasi laktosa ditunjukkan dengan terbentuknya gas didalam tabung durham. Cara ini biasanya digunakan untuk menentukan MPN koliform terhadap air atau minuman karena bakteri koliform termasuk bakteri yang dapat memfermentasi laktosa (Fardiaz, 1992).
Dalam metode MPN (most probable number) untuk uji kualitas mikrobiologi air dalam praktikum digunakan koliform sebagai indicator. Metode MPN merupakan uji deretan tabung yang menyemburkan pertumbuhan bakteri koliform sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah koliform dalam sampel yang diuji. Uji ini diawali dengan memasukkan 10 mL cairan dari sampel ke dalam lauryl tytose broth, uji awal ini disebut juga (presumptive test). Dalam uji duga setiap tabung yang menghasilkan gas dalam masa inkubasi diduga mengandung bakteri koliform. Uji dinyatakan positif bila terlihat gas dalam tabung durham. Tabung yang memperlihatkangas diuji lebih lanjut dengan uji peneguhan. Untuk uji peneguhan dilakukan untuk meneguhkan bahwa gas yang terbentuk disebabkan oleh kuman koliform dan bukan disebabkan oleh kerjasama beberapa spesies sehingga menghasilkan gas. Uji penegasan menggunakan BGLB yang diinokulasikan dengan satu mata ose media yang memperlihatkan hasil positif pada uji pemeriksaan (Layl, 1994).
Balteri koliform adalah jenis bakteri yang umum digunakan sebagai indicator penentuan kualitas sanitasi makanan dan air. Koliform sendiri sebenarnya bukan penebab dari penyakit-penyakit bawaan air, namun bakteri jenis ini mudah untuk dikultur dan keberadaannya dapat digunakan sebagai indicator keberadaan organism pathogen seperti bakteri lain, virus atau protozoa yang banyak dan merupakan parasit yang hidup dalam sistem pencernaan manusia serta terkandung dalam feses. Organism indicator digunakan karena ketika seseorang terinfeksi oleh bakteri pathogen, orang tersebut akan mengekskresi organism indicator jutaan kali lebih banyak daripada organism pathogen. Hal ini yang menjadi alasan untuk menyimpulkan bila tingkat keberadaan organism indicator rendah maka organism pathogen akan jauh lebih rendah atau bahkan tidak ada sama sekali (Servais, 2007).
Jenis bakteri koliform berbentuk bulat, gram negative, tidak berspora serta memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas apabila diinkubasi pada 35-37 derajat Celsius. Bakteri ini terdapat sangat banyak pada feses organism berdarah panas, dapat juga ditemukan dilingkungan perairan, di tanah dan pada vegetasi. Oleh karena dapat disimpulakan bahwa apabila erdapat bakteri koliform pada badan air maka badan air tersebut sudah tercemar oleh feses. Genus yang temasuk dalam kelompok bakteri koliform antara alain citrobakter, enterobakter, esceria, hafnia, klebsiella, serratia. Dalam penelitian ini perhitungan jumlah coliform dilakuakan dengan metode jumlah perkiraan terdekat (JPT) atau MPN. Metode ini terdiri dari tiga uji atau tes dengan tahapan uji perkiraan, uji penetapan, dan uji komplit. Praktikum uji mikrobiologis ini hanya menggunakan dua uji aitu uji perkiraan dan uji penetapan.
Uji perkiraan (presumtif test) merupakam uji yang menunjukkan organism yang dapat memfermentasi laktosa menghasilkan asam dan gas. Dari hasil percobaan dapat diketahui bahwa bakteri yang terkandung dalam sampel air dapat memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang ditunjukkan dengan adanya gelumbugn pada media. Menurut Fardiaz (1992), pada kondisi aerobic bakteri kolfiform mengoksidasi asam amino sedangkan jika tidak terdapat oksigen metabolisme menjadi bersifat fermentative dan energy diproduksi denegan cara memecah gula menjadi asam organic. Jenis bakteri ini dapat tumbuh pada medium sederhana pada kisaran pH dan suhu yang luas.
Uji penguat (confirmed test) merupakan lanjutan presumtif test. Pada uji ini digunakan media BGLB yang merupakan media selektif yang dapat ditumbuhi oleh bakteri koliform. Hasil positif pada tes ini menunjukkan besarnya kandungan total koliform pada sampel. Hasil diamati pada media yang telah ditanami dan telah diinkubasi pada 37 derajat Celsius selama 24 jam. Total koliform merupakan keseluruhan enterobakter. Uji ini sangat bergantung pada uji pendugaan karena nilai pengenceran dikalikan dengan angka yang ada pada tabel penentuan JPT yang merupakan awal dalam penentuan jumalh total koliform yang terdapat pada masing-masing sampel (Pelczar dan Chan, 1986).
Pengecatan gram pertama kali dikemukakan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan pengecatan ini film bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna Kristal violet dan didiamkan beberapa lama, kemudian disiram dengan larutan lugol dan dibiarkan terendam dalam waktu yang sama. Sampai tingkat pengecatan ini selesai, semua bakteri akan berwarna ungu. Selanjutnya preparat didekolorisasi dengan alcohol sampai semua zat warna tampakluntur. Kemudian dicuci dengan akuades dan preparat diberi warna kontras seperti fuchin basa.
Dianatara bermacam-macam bakteri yang dicat ada yang dapat menahan zat warna ungu (Kristal violet) dalam tubuhnya meskupun telah didekolorisasi dengan alcohol. Dengan demikian tubuh bakteri ini tetap berwarna ungu meskipun disertai dengan pengecatan oleh zat warna kontras warna ungu itu tetap dipertahankan. Bakteri ang member reaksi semacam ini disebut bakteri gram positif. Sebaliknya bakteri yang tidak dapat menahan zat warna setelah didekolorisasi dengan alcohol akan kembali menjadi tidak berwarna dan bila diberikan pengecatan dengan zat warna kontras akan berwarna sesuai dengan zat warna kontras (fuchin basa). Bakteri yang memperlihatkan reaksi semacam ini dinamakan bakteri gram negative.
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferential yang sangat berguna. Selain untuk melihat bentuk, pewarnaan ini juga bertujuan untuk mengetahui sifat dari bakteri.sehingaa dengan pewarnaan ini, maka dapat dibedakan antara gram positif dengan bakteri gram negative. Bakteri gram positif berwarna ungu yang disebakan kompleks zat warna Kristal violet, sedangkan bakteri gram negative berwarna merah yang disebabkan oleh warna kedua yaitu fuchin basa (Dwijoseputro, 2004).

Alat dan Bahan
  1. Air
  2. Lampu spritus
  3. Tabugn reaksi berisi tabung durham dengan 5 mL laktosa steril ganda (3 buah)
  4. Tabugn reaksi berisi tabung durham dengan 10 mL laktosa steril tunggal  (6 buah)
  5. Pipet 1 mL (steril)
  6. Pipet 10 mL (steril)
  7. Incubator
  8.  Tabung berisi BGLB steril
  9.  Jarum ose
  10. Sayur-sayuran 50-100 g
  11. 100 mL larutan pepton 
  12.  Cawan petri
  13. Media agar kaldu

Cara Kerja
a.       Tes perkiraan/presumtife test
  1. Memasukkan 10mL sampel air ke dalam 3 tabung reaksi tabung durham @ 5 mL media laktosa ganda.
  2. Memasukkan 1 mL sampel air ke dalam 3 tabung reaksi berisi tabugn durham @ 10 mL media laktosa tunggal pertama.
  3. Memasukkan 0,1 mL sampel air ke dalam 3 tabung reaksi berisi tabung durham @ 10 mL media laktosa tunggal terakhir.
  4. Menginkubasi semua tabung ke dalam incubator dengan temperature 37 derajat Celsius.
  5. Memeriksa tabung rekasi dalam 24 jam.
  6. Mengamati dan mencatat hasil.
  7. Memeriksa kembali tabung reaksi dalam 24 jam ke 2.
  8. Mengamati dan mencatat hasil dalam tabel pengamatan.
  9. Tabung yang positif.
b.      Tes penetapan untuk menentukan total koliform
  1. Menginokulasikan sedikit suspense bakteri yang memperlihatkan hasil positif ke dalam tabung rekasi berisi BGLB steril.
  2. 1 BGLB untuk 1 sampel.
  3. Menyimpan tabung ke dalam incubator dengan T=42 derajat Celsius selama 24 jam.
  4. Memeriksa masing-masing tabung untuk mengamati apakah terjadi pertumbuhan bakteri coliform atau tidak.
  5. Menetapkan JPT total koliform dalam 100 mL sampel air berdasarkan tabel JPT.
  6. Hasil pengamatan indeks JPT=2400 + MPN/100mL
c.       Pemeriksaan bahan makanan segar
  1. Sayuran dicuci dalama larutan pepton 100mL.
  2. Mengambil 1 mL air pepton dan memasukkan ke dalam 10-1 -9 mL akuades.
  3. Mengambil 1 mL dari sampel 10-1 dan memasukkan ke dalam 10-2.
  4. Mengambil 1 mL dari sampel 10-2 dan memasukkan ke dalam 10-3.
  5. Menginokulasikan masing-masing 1 mL dari sampel 10-1, 10-2, 10-3 diatas cawan petri steril dengan agar kaldu.
  6. Menginkubasi pada suhu 37 derajat Celsius selama 48 jam.
  7. Menghitung jumlah kolloni bakteri , jamur, dan ragi dalam sampel yang diperiksa.
d.      Pemeriksaan salmonella-sigella
  1. Memblender sisa sayuran + larutan cucian pepton 100mL sebelumnya.
  2. Menginokulasikan ke dalam 50 mL selenite brith (50 mL sampel).
  3. Menggesekkan sedikit suspense ke dalam permukaan ss agar dengan jarum ose secara steril.
  4. Inkubasi pada suhu 37 derajat Celsius selama 18-24 jam.
  5. Mengamati hasil.
  6. Melakukan pewarnaan gram pad sedikit koloni yan (+).

Analisis dan Pembahasan
Kegiatan praktikum mengenai uji mikrobiologi air dilakukan melalui tiga tahapan yaitu uji perkiraan, uji penetapan, dan uji lengkap. Semua uji melalui tahapan yang harus dilakukan sevcara bertahap. Praktikum uji mikrobiologis kali ini hanya menggunakan dua uji yaitu uji perkiraan dan uji penetapan.
Uji perkiraan (presumptive test) merupakan uji yang menunjukkan organism yang dapat memfermentasi laktosa menghasilkan asam dan gas. Hasil diamati pada media yang telah ditanam dan telah diinkubasi pada 37 derajat C selama 24 jam dan 48 jam. Dari hasil percobaan dapat diketahui bahwa bakteri yang terkandung dalam sampel air dapat memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang ditunjukkan dengan adanya gelembung pada tabung durham dan bau yang menyengat pada tabung. Hal ini menunjukkan sampel mengandung koliform. Pada kondisi aerobic bakteri ini mengoksidasi asam amino, sedangkan jika tidak terdapat oksigen metabolisme menjadi bersifat fermentative dan energy diproduksi dengan cara memecah gula menjadi assam organic. Jenis bakteri ini dapat tumbuh pada medium sederhana pada kisaran pH dan suhu yang luas. Pada praktikum ini 9 tabung dengan konsentrasi 10 mL, 1 mL dan 0,1 mL menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan gas yang terperangkap pada tabung durham dan bau yang ada pada tabung.
Uji penguat (cinfirmet test) merupakan lanjutan dari presumtif test. Pada uji ini digunakan media BGLB yang merupakan media slektif yang dapat ditumbuhi oleh bakteri koliform. Hasil positif pada tes ini menunjukkan besarnya kandungan total koliform pada sampel. Hasil diamati pada media yang telah ditanam dan telah diinkubasi pada 37 derajat C selama 24 jam. Total koliform merupakan keseluruhan enterobakter. Uji ini sangat bergantung pada uji pendugaan karena nilai pengenceran dikalikan dengan angka yang ada pada tabel penentuan JPT yang merupakan acuan dalam penentuan jumlah total koliform ang terdapat pada masing-masing sampel. Pengamatan menunjukkan bahwa hasil positif yang ditunjukkan dengan bau yang dihasilkan dan gas ang terperangkap dalam tabung durham. Pada pengenceran pertama ke 9 tabung menghasilkan pertumbuhan positif yaitu dengan seri tabung 3-3-3 pada ukuran 10 mL, 1mL, 0,1 mL yang positif ditumbuhi jasad renik. Sehingga dapat ditentukan indeks JPT yaitu 2400+MPN/100mL, maka dapat disimpulkan bila air mengandung koliform.
Metode most probable number (MPN) digunakan untuk medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungannya dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung durham yang diletakkan pada posisi terbalik, aitu untuk jasad renik pembentuk gas. Dalam metode MPN pengenceran harus dilakukan lebih tinggi daripada pengenceran dalam hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasi dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung satu sel. Beberapa tabung yang lainnya setelah diinkubasi diharapkan terjasi pertumbuhan pada beberapa tabung yang dinyatakan sebgai tabung positif.
Langkah percobaan yang dilakukan dimulai dengan 1 tetes sampel yang diduga berupa bakteri salmonella-sigela diteteskan di atas kaca preparat. Kaca preparat berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) diatas Bunsen. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapat bakteri saja.proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca preparat sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri yang dijaga agar tidak terkena nyala api selanjutnya dilakaukan pewarnaan gram.
Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu ang pertama Kristal violet diteteskan di atas kaca preparat tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian dibilas dengan akuades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan member warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti ini sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan garam negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.kristal violet yang diteteskan didiamkan agar cat dan pewarnaini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Langkah selanjutnya lugol diteteskan diatas kaca preparat tersebut kemudian didiamkan selama 15 detik kemudian dibilas dengan akuades hingga warnanya hilang. Lugol merupakan pewarna mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target ataau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks lugol terperangkap antara dinding sel dan membrane sitoplasme organism gram positif. Lugol ang diteteskan didiamkan selama 15 detik agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.
Selanjutnya alcohol diteteskan diatas kaca preparat kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu kaca preparat dibilas dengan akuades hingga warnanya hilang. Alcohol merupakan solven organic yang berfungsi untuk membilas kelebihan zat warna pada sel bakteri. Bila dinding sel tidak kuat menelan warna dasar maka warna akan tercuci. Pemberian alcohol mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu bakteri akan berwarna ungu atau merah muda. Pemberian alcohol juga menyebakan terekstrasinya lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Fungsi pendiaman untuk melunturkan warna secara sempurna.
Selanjutnya diteteskan fuchin basa diatas gelas benda tersebut dan didiamkan selama 3 menit. Setelah itu dibilas dengan akuades hingga warnanya hilang. Fuchin basa merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembaali sel yang telah kehilangan pearna utama setelah perlakuan denga alcohol. Pewarna fuchin basa termasuk ke dalam sel dank an menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negative sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alcohol, karena pori-pori mengkerut, daa rembes dinding sel dan membrane sel menurun sehingga pewarna fuchin basa tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
Setiap akhir pemberian reagen selalu dibilas dengan akuades agar kelebihan zat warna dapat dikurangi. Dan perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari akuades dengan kertas tisu atau kertas saring agar akuades tidak tercampur dengan pewarna yang diberikan. Setelah pembilasan terakhir kaca preparat dikeringkan dan diamati dibawah mikroskop. Dan pada praktikum kali ini pada kaca preparat terlihat warna merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negative. Sedangkan salmonella-sigella merupakan bakteri gram positif yang harusnya terbentuk warna ungu.

Kesimpulan
Bakteri khusus atau bakteri koliform merupakan jenis bakteri yang umum digunakan sebagi indicator penentuan kualitas sanitasi makanan dan air. Indeks JPT koliform dari hasil percobaan adalah 2400+MPN/100mL. dan salmonella-sigella yang diduga terdapat pada sumber sayuran mentah dinyatakan tidak ada dikarenakan pada kaca preparat hasil percobaan berwarna merah muda seharusnya ungu karena salmonella-sigella termsuk bakteri gram positif.

Daftar Pustaka
Buckle, et al., 1987, Ilmu Psngsn terjemahan Purnimo H., Adiono, UI Pres: Jakarta.
Dwijoseputro, 2005, Dasar-dasar Mikrobiologi, Djambatan: Jakarta.
Fardiaz, 1989, Mikrobiologi Pangan, Pusat Antar Universitas Panagn dan Gizi IPB: Bogor.
Hafizah, S., 2010, Gambaran pengetahuan Penyaji Makanan (Food Handler) Pada Rumah-rumah Makan di Jalan Dr. Mansur Tentang Amebiasis [Skripsi], Fakultas Kedokteran, Universitas Sumatra Utara: Medan.
Winarno, 2002, Kimia Pangan dan Gizi, PT. Gramedia Pustaka Utama: Jakarta.

1 Response to "Materi Praktikum Mikrobiologi ||Pemeriksaan Bakteri Khusus||"

  1. This comment has been removed by a blog administrator.

    ReplyDelete