Praktikum Biokimia || Penentuan Kadar Protein secara Spektrofotometri ||



Tujuan:
Dapat mempelajari uji kuantitatif protein dengan cara biuret menggunakan spektrofotometri.

Dasar Teori:
Penentuan kadar protein dengan cara biuret dilakukan berdasarkan atas pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks biru-ungu. Warna ini akan terjadi bila protein bereaksi terhadap tembaga dan ingkungan alkali.
Sesuai dengan Hukum Lambert-Beer, absorbsi sinar tampak oleh larutan berwarna akan berbanding lurus dengan konsentrasi zat terlarut yang menimbulkan warna.
Kita ingat kembali hukum Lambert-Beer:
-log T = A =abc
Dimana:
T = transmisi cahaya
A = absorbsi
a = absorbsivitas molar
b = panjang jalan sinar (tebal kuvet)
c = konsentrasi
dalam praktek dengan spektrofotometer sinar tampak nilai b tergantung pada tebal kuvet dan nilai ini dibuat konstan. Setiap kuvet dibuat sedemikian rupa sehingga memiliki nilai b yang sama dan konstan untuk satu jenis kuvet yang seukuran.
Dengan spektrofotometer tampak, nilai A untuk larutan berwarna dapat diukur. Untuk mencari konsentrasi (C) yang menimbulkan warna maka ada beberapa cara yang harus dikerjakan terlebih dahulu yaitu:
Mula-mula dibuat beberapa larutan standar dengan konsentrasi yang telah diketahui dengan tepat.
Larutan standar ini ditentukan nilai absorbansinya pada setiap panjang gelombang maksimum (panjang gelombang yang memberikan serapan maksimum) dengan spektorfotometer yang digunakan.
Dari data di atas, dibuat grafik A versus konsentrasi (C), dimana grafik akan memberikan garis linear dengan perpotongan (0,0). Grafik ini yang kita sebut sebagai grafik standar.
Suatu sampel dapat diketahui konsentrasinya dengan mengukur A dengan alat spektrofotometer dan menginterpolasikan data dengan grafik standar yang teah dibuat.
Cara ain untuk menentukan konsentrasi larutan sampel adalah dengan membandingkan absorbansi sampel dengan satu saja zat yang diketahui konsentrasinya. Cara seperti ini tentu saja memiiki kesalahan lebih besar dibandingkan cara pertama di atas, karena kesalahan dalam pengukuran dapat lebih besar dari hanya satu saja sampel standar. Adapun rumus yang berlaku pada cara ini adalah:
Cx = (Ax/As) x Cs
Dimana:
Cx = konsentrasi sampel
Cs = konsentrasi standar
Ax = absorbansi sampel
As = absorbansi standar
Konsentrasi sampel dan standar yang diukur dengan spektrofotometer sebaiknya dibuat sedemikian rupa sehingga nilai absorbansi yang diberikannya ada di antara batas-batas 0,12-1,0 atau niai transmitansinya ada di antara 0,1-0,75. Pembacaan %T atau A di luar batas tersebut akan memberikan kesaahan yang besar dalam konsentrasi disebabkan kesalahan fotometrik.

Alat:
Pipet ukur 1 mL
Tabung reaksi
Batang pengadung
Kertas labe
Boto semprot akuades
Kertas saring
Sikat tabung
Buret
Geas kimia
Spektrofotometer UV-Vis
Kertas tisu

Bahan:
Reagen biuret
Larutan serum albumin murni
Akuades

Cara Kerja:

Pembuatan Reagen Biuret
Reagen biuret terdiri dari kuprisufat dan natrium tartarat. Cara pembuatan reagen ini adalah dengan cara mearutkan 0,75 CuSO4.5H2O dan 3 gram natrium tartarat ke daam kira-kira 250 mL air dalam labu takar 500 mL. kemudian ke dalam larutan ditambahkan 150 mL larutan NaOH 10% sambil dikocok-kocok, kemudian encerkan sampai tanda. Larutan ini adalah reagen biuret yang dapat disimpan sampai lama.

Pembuatan Larutan Standar Protein
Buatlah secara kuantitatif serum albumin murni dalam air dengan kadar 10 mg/mL. catat konsentrasinya hingga 1 angka di belakang koma sebagai konsentrasi awal standar. Agar larutan tersebut arut tambahkan beberapa tetes NaOH 3%. Larutan standar protein dibuat dengan menggunakan pipet ukur 1 mL dan tabung-tabung reaksi dengan perincian sebagai berikut:
  1. 0,2 mL larutan protein standar + 0,8 mL akuades sehingga konsentrasinya menjadi 0,2 kali konsentrasi larutan awa standar.
  2. 0,4 mL larutan protein standar + 0,6 mL akuades sehingga konsentrasinya menjadi 0,4 kai konsentrasi larutan awa standar.
  3. 0,6 mL larutan protein standar + 0,4 mL akuades sehingga konsentrasinya menjadi 0,6 kali konsentrasi arutan awal standar.
  4. 0,8 mL larutan protein standar + 0,2 mL akuades sehingga konsentrasinya menjadi 0,8 kali konsentrasi larutan awal standar.
  5. 1 mL larutan protein standar.
Ke dalam masing-masing larutan yang dibuat, tambahkan 4 mL reagen biuret yang telah disiapkan pada buret dan lakukan pengocokan.
Lakukan pendiaman sampel selam 30 menit pada suhu kamar.
Siapkan larutan protein sampel dan tambahkan pula 4 mL larutan biuret.
Masing-masing larutan standar maupun larutan sampel diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.
Buatlah grafik standar dan tentukan konsentrasi arutan sampe dengan rafik standar.

Pembahasan:
Protein merupakan salah satu unsur makro yang terdapat pada bahan pangan selain lemak dan karbohidrat. Protein merupakan sumber asam amino yang mengandung unsur-unsur C, H, O dan N dalam ikatan kimia. Molekul protein juga mengandung fosfor, belerang dan ada beberapa jenis protein yang mengandung tembaga. Protein sangat mudah mengalami perubahan fisik maupun aktivitas biologis yang disebabkan oleh kandungan protein berupa polipeptida dengan berat molekul yang beragam.
Fungsi utama protein dalam tubuh adalah sebagai zat pembentuk jaringan baru dan mempertahankan jaringan yang sudah ada agar tidak mudah rusak. Protein juga dapat digunakan sebagai bahan bakar apabila keperluan energi tubuh tidak dapat terpenuhi oleh karbohidrat dan lemak. Protein juga berperan dalam mengatur proses daam tubuh. Dengan cara zat-zat pengatur proses dalam tubuh. Protein dapat mengatur keseimbangan cairan dalam jaringan dan pembuluh darah, yaitu dengan cara menimbulkan tekanan osmotik koloid. Tekanan osmotik tersebut dapat menarik cairan jaringan ke daam pembuuh darah. Selain itu sifat amfoter protein yang dapat bereaksi dengan asam dan basa, dapat mengatur keseimbangan asam basa dalam tubuh.
Pada praktikum kai akan diakukan analisis kuantitatif protein terhadap sampe teur ayam peteur dengan menggunakan metode spektrofotometer UV-Vis single beam dengan arutan biuret. Reaksi biuret merupakan reaksi warna yang umum untuk gugus peptida (-CO-NH-N) dan protein. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu karena terbentuk senyawa komplek antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan peptida. Senyawa dengan dipeptida memberikan warna ungu, biru dan merah. Spektrofotometer itu sendiri merupakan teknik analisis yang bertujuan untuk mengetahui jumah (konsentrasi) zat dalam suatu bahan berdasarkan spektroskopi khusus untuk panjang gelomabang UV-Visible. Pengertian spektroskopi sendiri adaah istiah atau nama yang digunakan untuk ilmu yang mempelajari tentang hubungan antara radiasi (sinar) dan energi ( yang memiliki fungsi panajang gelombang yang biasa disebut adalah dengan frekuensi) dengan benda.
Prinsip dari spektrofotometri adalah suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu ajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Metode ini dapat digunakan untuk sampel yang berupa arutan berwarna atau tidak berwarna, karena pada umumnya suatu alat spektrofotometri yang dilengkapi sumber cahaya untuk mengukur spektrum dan panjang gelombang pada arutan tertentu. Jumah sinar yang diserap atau diteruskan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponensial dari konsentrasi arutan dan pada panjang larutan yang dilalui sinar.
Prinsip kerja penentuan kadar protein dengan metode biuret adalah menganalisa adanya ikatan peptida dengan cara menambahkan reagen biuret ke dalam sampel yang kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer, reaksinya adalah sebagai berikut:
Pada tes biuret ini penambahan NaOH 10% pada protein menyebabkan terjadinya hidroisis ikatan peptida dari polimer protein. Hidrolisis ini menghasilkan monomer-monomer asam amino dan ada sebagiab gugus asam amino yang berubah menjadi amonia. Akibatnya hidrolisis itu jumlah gugus asam amino berkurang dan pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang berwarna ungu dapat terjadi oleh sebab itu protein bereaksi dengan tembaga dalam ingkungan alkali.
Pada dasarnya suatu peptida adaah asi-asam amino karena gugus –COOH dan –NH2 membentuk ikatan peptida. Peptida didapatkan dari hidrolisis protein yang tidak sempurna. Apabila peptida yang dihasilkan dihidrolisis lebih anjut akn dihasilkan asam-asam amino.
Sifat peptida ditentukan oleh gugus –COOH, -NH2 dan gugus R. sifat asam dan basa pada peptida ditentukan oleh gugus –COOH dan –NH2, namun pada rantai panjang gugus –COOH dan –NH2 yang terletak diujung rantai tidak lagi berpengaruh. Suatu peptida juga mempunyai titik isolistrik seperti pada asam amino. Reaksi biuret merupakan reaksi warna untuk peptida dan protein.
Dalam praktikum kali ini ada dua praktikum yang harus dilakukan yaitu preparasi sampe dan pembuatan kurva standar. Pada pembuatan kurva standar sampe yang digunakan adalah serum abumin murni. Serum albumin murni dimasukkan ke daam tabung berbeda dengan volume 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 dan 1. Setelah albumin murni dimasukkan ke dalam tabung, tambahkan akuades ke daam tabung hingga volumenya mencapai 1 mL kemudian ditambahkan lagi dengan 4 mL biuret. Sampel tersebut kemudian didiamkan selam 30 menit. Seteah 30 menit sampel diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panajang geombang 540 nm.
Pada preparasi sampel langkah yang harus dilakukan adalah memasukkan 2,5 mL sampel (putih telur) ke dalam abu 100 mL alu diencerkan dengan menambahkan akuades hingga tanda batas. Diambil 1 mL sampel yang telah diencerkan lalu dimasukkan ke dalam tabung yang selanjutnya ditambahkan 4 mL biuret. Seteah itu sampel dimasukkan ke dalam kuvet. Diusahakan larutan sampe yang masuk tidak membentuk gelembung. Kuvet yang telah diisi oleh sampel dapat diuji absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang geombang 540 nm.
Setelah melakukan perhitungan dengan menggunakan persamaan linear y = 0,0242x + 0,0337 kemudian konsentrasinya diaplikasikan ke dalam rumus dan didapatkan kadar protein sebesar 14,82%. Apabia membandingkan hasi praktikum dengan literatur didapatkan hasi dari literatur adaah 12,7%.

Kesimpulan:
Pada percobaan penentuan kadar protein secara biuret, terjadi pembentukan warna ungu ini menunjukkan adanya pembentukan senyawa kompleks dengan Cu2+. Penentuan kadar protein secara biuret didasarkan pada pengukuran serapan cahaya oeh ikatan kompleks yang berwarna ungu. Semakin tinggi konsentrasi larutan protein semakin banyak ikatan peptida daam larutan maka pembentukan kompleks semakin banyak, ini dapat dilihat dari warna ungu yang semakin pekat. Pengukuran nilai absorbansi larutan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 540nm. Dan didapatkan persamaan garis  y = 0,0242x + 0,0337 sehingga konsentrasinya 14,82%.

Daftar Pustaka: 
Lehninger, 1995, Dasar-dasar Biokimia, Erlangga, Jakarta.
Poedjadi, 1994, Dasar-dasar Biokimia, Jakarta, UI.
Sudarmadji, 1996, Analisis Bahan Makanan dan Pertanian, Liberty, Yogyakarta.
Winarno, 1992, Kimia Pangan dan Gizi, Gramedia, Jakarta.

0 Response to "Praktikum Biokimia || Penentuan Kadar Protein secara Spektrofotometri ||"

Post a Comment