Materi Praktikum Mikrobiologi ||Media||

Tujuan

1. Mengetahui cara membuat media pertumbuhan mikroorganisme.
2. Mengetahui jenis medium.
3. Mengetahui cara mensterilkan media.
4. Mampu  memebuat media dasar untuk media biakan mikroorganisme.

Landasan Teori

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolate mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya (Machmud, 2008). Bahan-bahan media pertumbuhan yaitu:

1.Bahan dasar

• Air sebagai pelarut
• Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45 derajat C.
• Gelatin juga memiliki fungsi sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya disbanding agar.
• Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotroph obligat.

2.Nutrisi atau zat makanan

Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolism sel yaitu berupa unsur-unsur makro seperti C, H, O, N, P unsur mikro seperti Fe, Mg, dan unsur pelican/trace element.

Sumber karbon dan energy yang dapat diperoleh berupa senyawa organic atau anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotroph memerlukan sumber karbon organic antara lain dari karbohidrat, protein, dan asam organic.

Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein, atau senyawa bernitrogen lainnya. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.

3.Bahan tambahan

Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indicator asam basa) ditambahkan untuk indicator perubahan pH akibat produksi asam organic hasil metabolism. Antibiotic ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba non target/kontaminan.

4.Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media

• Agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula, atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat yang pertama kali digunakan oleh Fraw and Walther hese untuk mebuat media. Jika dicampur dengan air dingin agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus dimaksukkan san dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam.
• Peptone, adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.
• Meat ekstrak, mengandung basa organic terbuat dari otak, limpa, plasenta dan daging sapi.
• Yeast extract, mengandung asam amino yang lengkap dan vitamin B komplek. Terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol.
• Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunakan adalah amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5 – 1 %.

Macam-macam media pertumbuhan (Machmud, 2008):

1.    Medium berdasarkan sifat fisik

Medium padat, yaitu media yang mengandung agar 1-1,5% sehingga setelah dingin media menjadi padat.

Medium setengah padat, yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami pencampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NFB (nitrogen free bromotymol blue). Semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan dibawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur, semisolid juga bertujuan untuk mencegah atau menekan difusi oksigen, misalnya bakteri yang tumbuh pada media NFB (nitrogen free bromotymol blue). Semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan dibawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media nitrate broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolism nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.

Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (nutrient broth), LB (lactose broth).

2.    Medium berdasarkan komposisi

Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya glukosa agar, mackonkey agar.

Media semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti. Misalnya PDA (potato dextrose agar) yang mengandung agar, deztrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.

Medium non sistesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi  yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya tomato juice agar, brain heart infusion agar, pancreatic extract.

3.    Medium berdasarkan tujuan 
Media untuk isolasi

Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya nutrient broth, blood agar. 
Media selektif/penghambat

Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambahn suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria bertani medium yang ditambah amphisilin untuk merangsang e.coli, resisten antibiotic dan menghambat kontaminan yang peka. 
Media diperkaya (enrichment)

Media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang tumbuh pada media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembangbiak, tetapi membutuhkan komponen kompleks: blood tellurite agar, bile agar, serum agar. 
Media untuk peremajaan kultur
Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur. 
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik
Media ini digunakan untuk mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba. 
Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk menegtahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indicator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. 
Media differsial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasakan karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diffential.

Syarat yang harus dipenuhi untuk media biakan:

• Mengandung nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroorganisme yang berkembang.
• Memiliki kelembaban optimum bagi pertumbuhan mikroorganisme.
• Mengandung oksigen (kultur bakteri aerob) dan pH sesuai.
• Harus bebas dari mikroba lain dan steril.

Alat dan Bahan

1. Peptone 6,5 g
2. Beef ekstrak 0,75 g/L
3. Akuades
4. Timbangan/neraca
5. Gelas beker
6. Labu erlemneyer
7. Autoklaf
8. Pengaduk kaca
9. Bacto agar 3 g (20 g/L media)
10. Pengaduk kaca
11. Tabung reaksi
12. Cawan petri
13. Lampu spritus dan kompor listrik

Cara Kerja

a.    Media cair (nutrient broth)

1. Menimbang peptone dan beef ekstrak.
2. Memasukkannya dalam beker glas.
3. Menambahkan akuades.
4. Mengaduknya dengan pengasuk kaca hingga larut.
5. Mengambil 250 mL media dan memasukkannya dalam Erlenmeyer.
6. Menutup labu dengan kapas yang dibungkus kertas pembungkus.
7. Mensterilisasi media dalam autoklaf.
8. Media cair (NB).

b.    Media padat (nutrient agar)

1. Menambahkan bacto agar dalam media cair.
2. Mengadukknya dengan pengaduk kaca hingga larut.
3. Memasukkannya dalam tabung reaksi.
4. Menutupnya dengan kapas dan kertas.
5. Mensterilisasi dalam autoklaf.
6. (temperature media kurang lebih 55 derajat C) dituang dalam cawan petri.

Analisis dan Pembahasan

Medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme diatas atau didalamnya, medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat,antara lain adalah harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan ditumbuhkan, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan agar mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik. Percobaan kali ini yaitu pembuatan medium NA dan NB.

Pada praktikum ini membuat media biakan padat dan media biakan cair. Bahan untuk membuat media biakan padat biasanya terbuat dari agar-agar atau NA (nutrient agar). Media padat yaitu media berbentuk padat yang mengandung agar 1-1,5%. Setelah NA selesai dibuat, sebelum masuk ke autoklaf dibungkus dengan kertas kayu terlebih dahulu untuk mencegah penguapan larutan-larutan NA saat dimasukkan ke autoklaf dan untuk meminimalisir agar media tidak terkontaminasi oleh bakteri. Mulut tabung hendaknya ditutup pula dengan kapas agar lebih rapat.

Sebelum membuat media biakan pastikan semua peralatan sudah steril dan dikerjakan secara aseptic. Aseptic adalah dimana keadaaan bebas dari jasad renik yang bersifat pathogen. Keadaan ini dicapai dengan menggunakan cara-cara tertentu; alat-alat yang disterilkan melalui proses pemanasan. Pathogen adalah parasite yang mampu menimbulkan penyakit pada inangnya. Pensterilan berfungsi untuk mencegah dan membersihkan peralatan dari mikroorganisme yang tidak diinginkan atau dibiakkan, sedangkan bekerja dengan aseptic bertujuan untuk menjaga agar tidak terjadi kontaminasi peralatan dan medium dari mikroorganisme yang berada di sekitar kita.

Pembuatan media padat dengan agar-agar harus benar-benar aseptic, begitu juga dengan pembuatan media cair dengan nutrient broth karena nutrient agar atau bahan-bahan untuk pembuatanmedia biakan bakteri mudah sekali dibiakan oleh bakteri lain apabila terkontaminasi. Karena media NA atau NB sangat tinggi sekali kandungan nutrisinya untuk kehidupan mikroorganisme. Jika peralatan dipastikan sudah steril dan NA yang sudah selesai dipanaskan atau dimasak maka NA sudah siap untuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ketika tabung reaksi akan diisi NA, ujung atau mulut tabung reaksi harus terlebih dahulu dipanaskan di atas api spritus untuk mencegah terkontaminasinya bakteri. NA pada praktikum ini dibuat dengan mengambil isoNB ditambah bacto agar.

NA (nutrient agar) digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri. Pembuatan medium percobaan ini dengan menggunakan NA (nutrient agar) dimana didalam pembuatannya terelebih dahulu dengan cara menimbang bahan yang akan digunakan ke dalam neraca analitik sesuai dengan jumlah yang diperlukan kemudian memasukkan bahan ke dalam Erlenmeyer 250 mL, dimana bahan tersebut adalah akuades, peptone, beef ekstrak dan bacto agar setelah itu dipanaskan diatas hot plate diikuti oleh pengadukan dengan menggunakan magnetic stirrer, tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini adalah untuk menghomogenkan NA dengan akuades, dimana dengan pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari NA dan Akuades. Setelah dipanaskan beberapa menit larutan berubah warna dari keruh menjadi kuning kecoklatan hal ini menandakan larutan telah homogeny. Kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf dengan mulut Erlenmeyer disumbat dengan kapas dan dilapisi kertas diluarnya. Tujuan dari penutupan ini agar meminimalkan kontaminasi. Pembuatan NA berdasarkan konsistensinya termasuk medium padat dan menurut kegunaannya termasuk medium padat.

Kemudian media NA dalam keadaan cair dimasukkan tabung reaksi dan cawan petri, dibuat agar miring, teknik geser, tuang dan sebar pada cawan petri. Pemaasukan agar pada tabung dalam keadaan cair bertujuan agar larutan agar yang dimasukkan belum mulai mengenyal, dapat menempati wadah dan terbentuk agar yang baik. Tabung disumbat dengan kapas, hal ini dilakukan agar media yang didalam tabung tidak terkontaminasi oleh mikroba. Lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 derajat C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Pensterilan media agar ini dilakukan untuk membunuh mikroba yang berpotensi untuk mengkontaminasi. Agar miring setelah disterilkan dimiringkan hingga beku. Kemiringan diatur dengan batas bawah kemiringan media 1 cm dari dasar tabung dan batas atas tidak lebih dari ¾ tinggi tabung reaksi. Kemiringan diatur untuk mempermudah pengkulturan mikroba, tapi tidak boleh terlalu mendekati mulut tabung untuk meminimalisis kontaminasi mikroba yang tidak diinginkan. Pemasukan agar pada cawan petri juga dalam keadaan cair lalu media agar ini disterilkan dengan cara membakar mulut cawan petri dengan Bunsen agar mikroba yang ada dalam cawan mati.

Biasanya plat NA digunakan untuk membiakkan bakteri yang bersifat aerob. Bakteri yang bersifat aerob adalah organisme yang membutuhkan oksigen. Karena plat NA jika dibuat media miring pada tabung, permukaan NA yang padat akan luas dan kandungan nutrisi seperti oksigen sangat tinggi sekali. dan media biakan NA posisinya dimiringkan tujuannya untuk mendapatkan permukaan yang luas untuk ditanami atau ditempatkan bakteri yang akan dibiakkan pada media tersebut. Setelah selesai biarkan selama 30 menit atau tunggu sampai menjadi padat atau mengeras dan jangan sampai terlupakan tutup tabung dengan kapas. Setelah padat bungkus tabung dengan kertas kayu hal ini berfungsi untuk meminimalisir terjadinya kontaminasi dengan bakteri dan mencegah air masuk ke dalam tabung reaksi tersebut, karena jika meresap atau air masuk ke dalam tabung aka nada bakteri yang berkembangbiak di dalam tabung selai bakteri yang dibiakkan, dank arena itu harus benar-benar terjaga sekali kesterilannya.

Nutrient broth merupakan media sederhana yang dibuat dari beef ekstrak dan pepton. NB biasanya digunakan untuk inkubasi atau menumbuhkan bakteri dalam media cair. Berdasarkan komposisinya NB termasuk ke dalam medium semisintetik yaitu medium yang komponen dan takarannya sebagian diketahui dan sebagian lagi tidak diketahui secara pasti. Dalam praktikum ini nutrient broth adalah dibuat dengan komposisi peptone 6,5 g, beef ekstrak 0,75 g dan akuades 250 L. NB berwarna coklat. Sebelum digunakan pepton dan beef ektrak tidak larut sepenuhnya dalam air, tetapi masih terlihat serbuk-serbuknya berwarna kuning. Setelah dipanaskan serbuk media larut seluruhnya dalam air, berwarna kuning dan menjadi jernih. Setelah diamati ternyata NB hamper sama dengan NA. namun hal yang membedakan keduanya adalah NB digunakan untuk menumbuhkan bakteri dalam medium cair sedangkan NA digunakan untuk menumbuhkan bakteri dalam medium padat (agar). NA berasal dari NB ditambah agar.

Jadi media padat yang telah dibuat yaitu media NA dan NB akan dipakai pada praktikum berikutnya yaitu penanaman bakteri (isolasi bakteri). Jika pada praktikum penanaman biakan bakteri berhasil, maka praktikum pembuatan media atau pada praktikum ini berhasil. Tetapi pada praktikum pembiakan tidak berhasil, kemungkinan hal tersebut disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya adalah kurang sterilnya dalam membersihkan peralatan saat bekerja atau membuat medium kurang aseptic misalnya karena banyak berbicara, meletakkan peralatan yang sudah steril di sembarang tempat sehingga bakteri atau spora menempel pada peralatan.

Kesimpulan

Dari hasil praktikum media ini ada beberapa hal yang dapat disimpulkan yaitu:

1. Dapat membuat media pertumbuhan mikroorganisme yaitu media padat dan media cair.
2. Cara mensterilkan media yaitu dengan uap tekanan tinggi atau autoklaf sehingga alat dan media steril.

Daftar Pustaka

Dwijoseputro, D., 1994, Dasar-dasar Mikrobiologi, Djambatan, Jakarta.

Hadioetomo, R., 1993, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi, Gramedia, Jakarta.

Lim, D., 1998, Mikrobiologi, 2^nd edition, Mc  Grow-Hill Book, New York.

Schegel, G.H., 1998, General Mikrobiologi Sevent edition, Cambrige University Press, USA.

Suriawiria, U., 2005, Mikrobiologi Dasar, Papas Sinar Sinanti, Jakarta.

Volk dan Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi Kelima, Erlangga, Jakarta.

Posted by Unknown