Tujuan
Dapat memeriksa dan mengetahui apa itu bakteri khusus
(coliform).
Landasan Teori
Populasi mikroba tidak terpisah
sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Oleh
karena itu, dalam mempelajarinya bakteri harus diambil dari alam lalu
diisolasikan dalam suatu biakan murni. Di dalam laboratorium populasi bakteri
ini dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya. Biakan murni
adalah biakan yang berisi satu jenis bakteri (Pelczar, et al., 1988).
Ada berbagai cara untuk mengisolasi
bakteri dalam biakan murni yaitu dengan cara pengenceran, penuangan,
penggesekan atau penggoresan, penyebaran, pengucilan satu sel dan inokulasi
pada hewan. Masing-masing mempunyai kelebihan dan kekurangannya (Waluyo, 2007).
Cara pengenceran yaitu dengan
mengencerkan misalnya 1 ose bakteri dengan air. Lalu hasil pengenceran tersebut
dierkan lagi dengan beberapa ketentuan. Hal ini bertujuan untuk mengurangi
konsentrasi bakteri (Barazandesh, 2008).
Metode MPN atau JPT dapat digunakan
untuk menghitung jumlah jasad renik tertentu yang terdapat diantara campuran
jasad renik lainnya. Sebagai contoh jika digunakan lactose broth maka adanya
bakteri yang dapat memfermentasi laktosa ditunjukkan dengan terbentuknya gas
didalam tabung durham. Cara ini biasanya digunakan untuk menentukan MPN
koliform terhadap air atau minuman karena bakteri koliform termasuk bakteri
yang dapat memfermentasi laktosa (Fardiaz, 1992).
Dalam metode MPN (most probable
number) untuk uji kualitas mikrobiologi air dalam praktikum digunakan koliform
sebagai indicator. Metode MPN merupakan uji deretan tabung yang menyemburkan
pertumbuhan bakteri koliform sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah
koliform dalam sampel yang diuji. Uji ini diawali dengan memasukkan 10 mL
cairan dari sampel ke dalam lauryl tytose broth, uji awal ini disebut juga (presumptive
test). Dalam uji duga setiap tabung yang menghasilkan gas dalam masa inkubasi
diduga mengandung bakteri koliform. Uji dinyatakan positif bila terlihat gas
dalam tabung durham. Tabung yang memperlihatkangas diuji lebih lanjut dengan
uji peneguhan. Untuk uji peneguhan dilakukan untuk meneguhkan bahwa gas yang
terbentuk disebabkan oleh kuman koliform dan bukan disebabkan oleh kerjasama
beberapa spesies sehingga menghasilkan gas. Uji penegasan menggunakan BGLB yang
diinokulasikan dengan satu mata ose media yang memperlihatkan hasil positif
pada uji pemeriksaan (Layl, 1994).
Balteri koliform adalah jenis bakteri
yang umum digunakan sebagai indicator penentuan kualitas sanitasi makanan dan
air. Koliform sendiri sebenarnya bukan penebab dari penyakit-penyakit bawaan
air, namun bakteri jenis ini mudah untuk dikultur dan keberadaannya dapat
digunakan sebagai indicator keberadaan organism pathogen seperti bakteri lain,
virus atau protozoa yang banyak dan merupakan parasit yang hidup dalam sistem
pencernaan manusia serta terkandung dalam feses. Organism indicator digunakan
karena ketika seseorang terinfeksi oleh bakteri pathogen, orang tersebut akan
mengekskresi organism indicator jutaan kali lebih banyak daripada organism pathogen.
Hal ini yang menjadi alasan untuk menyimpulkan bila tingkat keberadaan organism
indicator rendah maka organism pathogen akan jauh lebih rendah atau bahkan
tidak ada sama sekali (Servais, 2007).
Jenis bakteri koliform berbentuk
bulat, gram negative, tidak berspora serta memfermentasi laktosa dengan
menghasilkan asam dan gas apabila diinkubasi pada 35-37 derajat Celsius. Bakteri
ini terdapat sangat banyak pada feses organism berdarah panas, dapat juga
ditemukan dilingkungan perairan, di tanah dan pada vegetasi. Oleh karena dapat
disimpulakan bahwa apabila erdapat bakteri koliform pada badan air maka badan
air tersebut sudah tercemar oleh feses. Genus yang temasuk dalam kelompok
bakteri koliform antara alain citrobakter, enterobakter, esceria, hafnia,
klebsiella, serratia. Dalam penelitian ini perhitungan jumlah coliform
dilakuakan dengan metode jumlah perkiraan terdekat (JPT) atau MPN. Metode ini
terdiri dari tiga uji atau tes dengan tahapan uji perkiraan, uji penetapan, dan
uji komplit. Praktikum uji mikrobiologis ini hanya menggunakan dua uji aitu uji
perkiraan dan uji penetapan.
Uji perkiraan (presumtif test)
merupakam uji yang menunjukkan organism yang dapat memfermentasi laktosa
menghasilkan asam dan gas. Dari hasil percobaan dapat diketahui bahwa bakteri
yang terkandung dalam sampel air dapat memfermentasi laktosa menjadi asam dan
gas yang ditunjukkan dengan adanya gelumbugn pada media. Menurut Fardiaz
(1992), pada kondisi aerobic bakteri kolfiform mengoksidasi asam amino
sedangkan jika tidak terdapat oksigen metabolisme menjadi bersifat fermentative
dan energy diproduksi denegan cara memecah gula menjadi asam organic. Jenis bakteri
ini dapat tumbuh pada medium sederhana pada kisaran pH dan suhu yang luas.
Uji penguat (confirmed test)
merupakan lanjutan presumtif test. Pada uji ini digunakan media BGLB yang
merupakan media selektif yang dapat ditumbuhi oleh bakteri koliform. Hasil positif
pada tes ini menunjukkan besarnya kandungan total koliform pada sampel. Hasil diamati
pada media yang telah ditanami dan telah diinkubasi pada 37 derajat Celsius selama
24 jam. Total koliform merupakan keseluruhan enterobakter. Uji ini sangat
bergantung pada uji pendugaan karena nilai pengenceran dikalikan dengan angka
yang ada pada tabel penentuan JPT yang merupakan awal dalam penentuan jumalh
total koliform yang terdapat pada masing-masing sampel (Pelczar dan Chan,
1986).
Pengecatan gram pertama kali
dikemukakan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan pengecatan ini film
bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna Kristal violet dan
didiamkan beberapa lama, kemudian disiram dengan larutan lugol dan dibiarkan
terendam dalam waktu yang sama. Sampai tingkat pengecatan ini selesai, semua
bakteri akan berwarna ungu. Selanjutnya preparat didekolorisasi dengan alcohol sampai
semua zat warna tampakluntur. Kemudian dicuci dengan akuades dan preparat
diberi warna kontras seperti fuchin basa.
Dianatara bermacam-macam bakteri yang
dicat ada yang dapat menahan zat warna ungu (Kristal violet) dalam tubuhnya
meskupun telah didekolorisasi dengan alcohol. Dengan demikian tubuh bakteri ini
tetap berwarna ungu meskipun disertai dengan pengecatan oleh zat warna kontras
warna ungu itu tetap dipertahankan. Bakteri ang member reaksi semacam ini
disebut bakteri gram positif. Sebaliknya bakteri yang tidak dapat menahan zat
warna setelah didekolorisasi dengan alcohol akan kembali menjadi tidak berwarna
dan bila diberikan pengecatan dengan zat warna kontras akan berwarna sesuai
dengan zat warna kontras (fuchin basa). Bakteri yang memperlihatkan reaksi
semacam ini dinamakan bakteri gram negative.
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan
diferential yang sangat berguna. Selain untuk melihat bentuk, pewarnaan ini
juga bertujuan untuk mengetahui sifat dari bakteri.sehingaa dengan pewarnaan
ini, maka dapat dibedakan antara gram positif dengan bakteri gram negative. Bakteri
gram positif berwarna ungu yang disebakan kompleks zat warna Kristal violet,
sedangkan bakteri gram negative berwarna merah yang disebabkan oleh warna kedua
yaitu fuchin basa (Dwijoseputro, 2004).
Alat dan Bahan
- Air
- Lampu spritus
- Tabugn reaksi berisi tabung durham dengan 5 mL laktosa steril ganda (3 buah)
- Tabugn reaksi berisi tabung durham dengan 10 mL laktosa steril tunggal (6 buah)
- Pipet 1 mL (steril)
- Pipet 10 mL (steril)
- Incubator
- Tabung berisi BGLB steril
- Jarum ose
- Sayur-sayuran 50-100 g
- 100 mL larutan pepton
- Cawan petri
- Media agar kaldu
Cara Kerja
a. Tes
perkiraan/presumtife test
- Memasukkan 10mL sampel air ke dalam 3 tabung reaksi tabung durham @ 5 mL media laktosa ganda.
- Memasukkan 1 mL sampel air ke dalam 3 tabung reaksi berisi tabugn durham @ 10 mL media laktosa tunggal pertama.
- Memasukkan 0,1 mL sampel air ke dalam 3 tabung reaksi berisi tabung durham @ 10 mL media laktosa tunggal terakhir.
- Menginkubasi semua tabung ke dalam incubator dengan temperature 37 derajat Celsius.
- Memeriksa tabung rekasi dalam 24 jam.
- Mengamati dan mencatat hasil.
- Memeriksa kembali tabung reaksi dalam 24 jam ke 2.
- Mengamati dan mencatat hasil dalam tabel pengamatan.
- Tabung yang positif.
b. Tes
penetapan untuk menentukan total koliform
- Menginokulasikan sedikit suspense bakteri yang memperlihatkan hasil positif ke dalam tabung rekasi berisi BGLB steril.
- 1 BGLB untuk 1 sampel.
- Menyimpan tabung ke dalam incubator dengan T=42 derajat Celsius selama 24 jam.
- Memeriksa masing-masing tabung untuk mengamati apakah terjadi pertumbuhan bakteri coliform atau tidak.
- Menetapkan JPT total koliform dalam 100 mL sampel air berdasarkan tabel JPT.
- Hasil pengamatan indeks JPT=2400 + MPN/100mL
c. Pemeriksaan
bahan makanan segar
- Sayuran dicuci dalama larutan pepton 100mL.
- Mengambil 1 mL air pepton dan memasukkan ke dalam 10-1 -9 mL akuades.
- Mengambil 1 mL dari sampel 10-1 dan memasukkan ke dalam 10-2.
- Mengambil 1 mL dari sampel 10-2 dan memasukkan ke dalam 10-3.
- Menginokulasikan masing-masing 1 mL dari sampel 10-1, 10-2, 10-3 diatas cawan petri steril dengan agar kaldu.
- Menginkubasi pada suhu 37 derajat Celsius selama 48 jam.
- Menghitung jumlah kolloni bakteri , jamur, dan ragi dalam sampel yang diperiksa.
d. Pemeriksaan
salmonella-sigella
- Memblender sisa sayuran + larutan cucian pepton 100mL sebelumnya.
- Menginokulasikan ke dalam 50 mL selenite brith (50 mL sampel).
- Menggesekkan sedikit suspense ke dalam permukaan ss agar dengan jarum ose secara steril.
- Inkubasi pada suhu 37 derajat Celsius selama 18-24 jam.
- Mengamati hasil.
- Melakukan pewarnaan gram pad sedikit koloni yan (+).
Analisis dan Pembahasan
Kegiatan praktikum mengenai uji
mikrobiologi air dilakukan melalui tiga tahapan yaitu uji perkiraan, uji
penetapan, dan uji lengkap. Semua uji melalui tahapan yang harus dilakukan
sevcara bertahap. Praktikum uji mikrobiologis kali ini hanya menggunakan dua
uji yaitu uji perkiraan dan uji penetapan.
Uji perkiraan (presumptive test)
merupakan uji yang menunjukkan organism yang dapat memfermentasi laktosa
menghasilkan asam dan gas. Hasil diamati pada media yang telah ditanam dan
telah diinkubasi pada 37 derajat C selama 24 jam dan 48 jam. Dari hasil
percobaan dapat diketahui bahwa bakteri yang terkandung dalam sampel air dapat
memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang ditunjukkan dengan adanya
gelembung pada tabung durham dan bau yang menyengat pada tabung. Hal ini
menunjukkan sampel mengandung koliform. Pada kondisi aerobic bakteri ini
mengoksidasi asam amino, sedangkan jika tidak terdapat oksigen metabolisme
menjadi bersifat fermentative dan energy diproduksi dengan cara memecah gula
menjadi assam organic. Jenis bakteri ini dapat tumbuh pada medium sederhana
pada kisaran pH dan suhu yang luas. Pada praktikum ini 9 tabung dengan
konsentrasi 10 mL, 1 mL dan 0,1 mL menunjukkan hasil positif yang ditandai
dengan gas yang terperangkap pada tabung durham dan bau yang ada pada tabung.
Uji penguat (cinfirmet test)
merupakan lanjutan dari presumtif test. Pada uji ini digunakan media BGLB yang
merupakan media slektif yang dapat ditumbuhi oleh bakteri koliform. Hasil positif
pada tes ini menunjukkan besarnya kandungan total koliform pada sampel. Hasil diamati
pada media yang telah ditanam dan telah diinkubasi pada 37 derajat C selama 24
jam. Total koliform merupakan keseluruhan enterobakter. Uji ini sangat
bergantung pada uji pendugaan karena nilai pengenceran dikalikan dengan angka
yang ada pada tabel penentuan JPT yang merupakan acuan dalam penentuan jumlah
total koliform ang terdapat pada masing-masing sampel. Pengamatan menunjukkan
bahwa hasil positif yang ditunjukkan dengan bau yang dihasilkan dan gas ang
terperangkap dalam tabung durham. Pada pengenceran pertama ke 9 tabung
menghasilkan pertumbuhan positif yaitu dengan seri tabung 3-3-3 pada ukuran 10
mL, 1mL, 0,1 mL yang positif ditumbuhi jasad renik. Sehingga dapat ditentukan
indeks JPT yaitu 2400+MPN/100mL, maka dapat disimpulkan bila air mengandung
koliform.
Metode most probable number (MPN)
digunakan untuk medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungannya
dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh
jasad renik. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung
yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau
terbentuknya gas di dalam tabung durham yang diletakkan pada posisi terbalik,
aitu untuk jasad renik pembentuk gas. Dalam metode MPN pengenceran harus
dilakukan lebih tinggi daripada pengenceran dalam hitungan cawan, sehingga
beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasi dengan larutan hasil
pengenceran tersebut mengandung satu sel. Beberapa tabung yang lainnya setelah
diinkubasi diharapkan terjasi pertumbuhan pada beberapa tabung yang dinyatakan
sebgai tabung positif.
Langkah percobaan yang dilakukan
dimulai dengan 1 tetes sampel yang diduga berupa bakteri salmonella-sigela
diteteskan di atas kaca preparat. Kaca preparat berisi sampel tersebut
dipanaskan (fiksasi) diatas Bunsen. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air
sehingga hanya akan didapat bakteri saja.proses fiksasi juga bertujuan supaya
bakteri benar-benar melekat pada kaca preparat sehingga olesan bakteri berupa
tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu
diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri yang
dijaga agar tidak terkena nyala api selanjutnya dilakaukan pewarnaan gram.
Pewarnaan gram pada praktikum ini
dilakukan dalam 4 tahap yaitu ang pertama Kristal violet diteteskan di atas
kaca preparat tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian dibilas dengan
akuades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna
ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan member warna
pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu
berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan
seperti ini sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Perbedaan
respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri didasarkan pada struktur
dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan
garam negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding
selnya tipis.kristal violet yang diteteskan didiamkan agar cat dan pewarnaini
dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Langkah selanjutnya lugol
diteteskan diatas kaca preparat tersebut kemudian didiamkan selama 15 detik
kemudian dibilas dengan akuades hingga warnanya hilang. Lugol merupakan pewarna
mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme
target ataau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan gram
dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks lugol
terperangkap antara dinding sel dan membrane sitoplasme organism gram positif. Lugol
ang diteteskan didiamkan selama 15 detik agar pengikatan warna oleh bakteri
menjadi semakin lebih kuat.
Selanjutnya alcohol diteteskan
diatas kaca preparat kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu kaca
preparat dibilas dengan akuades hingga warnanya hilang. Alcohol merupakan
solven organic yang berfungsi untuk membilas kelebihan zat warna pada sel
bakteri. Bila dinding sel tidak kuat menelan warna dasar maka warna akan
tercuci. Pemberian alcohol mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu
bakteri akan berwarna ungu atau merah muda. Pemberian alcohol juga menyebakan
terekstrasinya lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Fungsi pendiaman
untuk melunturkan warna secara sempurna.
Selanjutnya diteteskan fuchin basa
diatas gelas benda tersebut dan didiamkan selama 3 menit. Setelah itu dibilas
dengan akuades hingga warnanya hilang. Fuchin basa merupakan pewarna tandingan
atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembaali sel yang telah
kehilangan pearna utama setelah perlakuan denga alcohol. Pewarna fuchin basa
termasuk ke dalam sel dank an menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada
bakteri gram negative sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya
terdehidrasi dengan perlakuan alcohol, karena pori-pori mengkerut, daa rembes
dinding sel dan membrane sel menurun sehingga pewarna fuchin basa tidak dapat
masuk sehingga sel berwarna ungu.
Setiap akhir pemberian reagen
selalu dibilas dengan akuades agar kelebihan zat warna dapat dikurangi. Dan perlu
dilakukan penyerapan air bilasan dari akuades dengan kertas tisu atau kertas
saring agar akuades tidak tercampur dengan pewarna yang diberikan. Setelah pembilasan
terakhir kaca preparat dikeringkan dan diamati dibawah mikroskop. Dan pada
praktikum kali ini pada kaca preparat terlihat warna merah muda maka termasuk
golongan bakteri gram negative. Sedangkan salmonella-sigella merupakan bakteri
gram positif yang harusnya terbentuk warna ungu.
Kesimpulan
Bakteri khusus atau bakteri
koliform merupakan jenis bakteri yang umum digunakan sebagi indicator penentuan
kualitas sanitasi makanan dan air. Indeks JPT koliform dari hasil percobaan
adalah 2400+MPN/100mL. dan salmonella-sigella yang diduga terdapat pada sumber
sayuran mentah dinyatakan tidak ada dikarenakan pada kaca preparat hasil
percobaan berwarna merah muda seharusnya ungu karena salmonella-sigella termsuk
bakteri gram positif.
Daftar Pustaka
Buckle, et al., 1987, Ilmu Psngsn terjemahan Purnimo
H., Adiono, UI Pres: Jakarta.
Dwijoseputro, 2005, Dasar-dasar Mikrobiologi,
Djambatan: Jakarta.
Fardiaz, 1989, Mikrobiologi Pangan, Pusat Antar
Universitas Panagn dan Gizi IPB: Bogor.
Hafizah, S., 2010, Gambaran
pengetahuan Penyaji Makanan (Food Handler) Pada Rumah-rumah Makan di Jalan Dr.
Mansur Tentang Amebiasis [Skripsi], Fakultas Kedokteran, Universitas Sumatra
Utara: Medan.
Winarno, 2002, Kimia Pangan dan Gizi, PT. Gramedia Pustaka
Utama: Jakarta.
This comment has been removed by a blog administrator.
ReplyDelete